Článek je věnován srovnávací analýze fungicidní aktivity léčiv obsahujících flukonazol jako účinnou látku na testovacích kmenech 3 druhů kvasinek rodu Candida: C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata in vitro. provádí dvojitě zaslepeným způsobem. Byl použit originální lék Diflucan obsahující flukonazol a 5 jeho generik. Kvasinky byly vysety na médium Sabouraud a PGDA. V práci byla použita metoda well-difusion. Léky v kapslích byly studovány v suspenzi v koncentracích 150 a 2 mg/ml. Diflucan pro intravenózní podání sloužil jako kontrola. Experimenty byly prováděny v 15násobných opakováních, 3krát. Výsledky byly hodnoceny podle velikosti zóny inhibice růstu kvasinek (v mm).
Ve srovnávací studii léčiv obsahujících flukonazol vykazoval diflucan největší statisticky významnou fungicidní aktivitu na všechny tři modelové kmeny kvasinek v maximální (150 mg/ml) a minimální (2 mg/ml) koncentraci. Fungicidní aktivita zapouzdřené formy Diflucanu (2 mg/ml) a kapalné formy pro intravenózní podání (2 mg/ml) nebyla statisticky významně odlišná jak u C. albicans, tak u C. parapsilosis. Nejcitlivější na drogu byly C. albicans a C. parapsilosis. Diflucan inhibuje růst C. glabrata statisticky významně výrazněji než jiné léky obsahující flukonazol.
Klíčová slova
houby rodu Candida
antimykotika
flukonazol
Flukonazol je antimykotikum pro systémové použití, které se osvědčilo zejména při léčbě mykóz způsobených kvasinkami rodu Candida. Flukonazol je podle své biochemické struktury derivát triazolu a funkčně patří k vysoce aktivním selektivním inhibitorům syntézy steroidů v buňkách hub. V nízkých koncentracích flukonazol narušuje biosyntézu buněčné membrány hub, což vede k rozvoji fungistatického účinku (inhibice růstu). Při vysokých koncentracích dochází vlivem peroxidace a dalších procesů v buňce k odumírání houby (fungicidní účinek). Na rozdíl od jiných azolových léků má flukonazol vysokou specificitu pro houbové enzymy závislé na cytochromu p=450 [6].
Molekula flukonazolu byla syntetizována a patentována společností Pfizer (USA). Později, po vypršení patentu, se na farmakologickém trhu objevila generika, která obsahují i flukonazol. Je známo, že generické léky jsou srovnávány s originálním lékem v různých parametrech (bioekvivalence, biologická dostupnost, farmakokinetika atd.) [9].
Účelem naší studie je zhodnotit fungicidní aktivitu různých antimykotik, mezi které patří flukonazol, na laboratorních kulturách různých kvasinek rodu Candida.
Materiál a metody výzkumu
V práci byl použit originální lék obsahující flukonazol – diflucan (Pfizer, USA) a generika flukonazolu: diflazon (KRKA, Slovinsko), flucostat (Pharmstandard-Leksredstva, Rusko), mycosist (Gedeon Richter, Maďarsko), flukonazol (Hemofarm, Srbsko) , mycomax (Zentiva, Česká republika). Při pokusech bylo použito minimálně 5 balení stejnojmenného léku z různých lékáren v Moskvě. Léky byly studovány v koncentracích 150 a 2 mg/ml. Diflucan byl použit jako kontrola pro intravenózní podání v koncentraci 2 mg/ml. Pro studii byly použity testovací kmeny Candida albicans (VKPMY-3108), candida glabrata (KBP 3049) a Candida parapsilosis (KBP 3050), Sabouraudovo médium a pepton-glukóza-kvasinkový agar.
Byla použita metoda well-difusion. 20 ml agarového média bylo přidáno do Petriho misky. Uprostřed 2/3 tloušťky agarové vrstvy byla vytvořena jamka. Poté byl trávník naočkován kmeny kvasinek a do jamky byly přidány přípravky ve dvou koncentracích, jak je uvedeno výše. inkubace byla prováděna při 37 °C po dobu 24 hodin, poté byla změřena zóna inhibice růstu kvasinek a misky byly vyfotografovány (obr. 1, viz příloha).
Zóny inhibice růstu plísní (úplná inhibice růstu kolonií) byly měřeny v mm. Pro kontrolu zón inhibice růstu byla provedena mikroskopie fragmentů agaru (obr. 2, 3, viz příloha).
Výsledky výzkumu a diskuse
Všechny studované flukonazolové přípravky inhibovaly růst tří typů kvasinek v koncentracích 150 mg/ml a 2 mg/ml. Současně byly zóny inhibice růstu kvasinek vytvořené v důsledku expozice Diflucanu zpravidla významně větší než zóny vyplývající z expozice jiným lékům obsahujícím flukonazol (viz tabulka).
Ve všech experimentech s C. albicans zóny inhibice růstu byly významně větší při expozici Diflucanu než jiným lékům.
s ohledem na C. parapsilosispak při koncentraci léčiva 150 mg/ml byly zóny inhibice růstu kvasinek statisticky významně větší, když byly vystaveny Diflucanu než jiným léčivům. Při koncentraci léčiva 2 mg/ml se rozdíl ve velikosti zóny inhibice růstu při expozici Diflucanu a Mycosistu ukázal jako statisticky nevýznamný.
V experimentech s C.glabrata při koncentraci léčiva 150 mg/ml byly zóny inhibice růstu kvasinek statisticky významně větší, když byly vystaveny Diflucanu než jiným léčivům. Při koncentraci léčiva 2 mg/ml byly zóny inhibice růstu statisticky významně větší při expozici Diflucanu ve srovnání s flukonazolem, Mycosist, Mycomax a Flucostat.
Ve srovnávací studii fungicidní aktivity Diflucanu na různé druhy kvasinek byly nejcitlivější C. albicans и C. parapsilosis (obr. 4, viz příloha).
Různé druhy rodu Candida a především Candida albicans, může způsobit poškození kůže, gastrointestinálního traktu a pohlavních orgánů. Vulvovaginální kandidóza je jedním z nejčastějších důvodů, proč ženy navštěvují gynekologa [2]. Podle řady autorů [1,3,5,8], C. albicans izolovaný od 73–90 % pacientů s vulvovaginální kandidózou, C.glabrata – v 15-35% ostatní druhy kvasinek vč C. parapsilosis, – ve 4-19 % [8-11]. Tato data určila výběr modelových druhů kvasinek pro naše experimenty, ve kterých byla studována antimykotická aktivita flukonazolu.
Důležitou otázkou je, jak interpretovat získané výsledky. Je rozdíl 1 mm ve velikosti zóny inhibice růstu kvasinek hodně nebo málo? Zejména při srovnání antimykotické aktivity léků, mezi které patří flukonazol. V současné době nepanuje mezi mykology shoda. Tato problematika však byla dobře prostudována na příkladu bakterií. Tedy například pokud, při vystavení Pseudomonas aeruginose u tikarcilinu je zóna inhibice růstu mikroorganismů ≤14 mm – tento kmen je rezistentní, a pokud je ≥15 mm, je kmen citlivý na toto léčivo [7].
Při studiu in vitro fungicidní aktivity Diflucanu a jeho různých generik se ukázalo, že všechny studované léky mají tuto vlastnost. Tato činnost se však projevuje v různé míře. Diflucan má největší statisticky významnou fungicidní aktivitu na všech třech modelových kmenech, a to jak v maximálních, tak v minimálních koncentracích. Kromě toho je velmi důležité, aby tento lék inhiboval nejen růst kmenů C. albicans, ale i jiné druhy kvasnic. Ukázalo se, že je výrazně citlivější na Diflucan C. albicans и C. parapsilosisnež rezistentní vůči různým antimykotikům C.glabrata [2,10]. Naše zjištění dokazují, že Diflucan potlačuje růst C.glabrata statisticky významně výraznější než ostatní studované léky obsahující flukonazol. Podobné výsledky ve srovnávací studii fungicidní aktivity Diflucanu a některých jeho generik byly získány na jiných druzích kvasinek rodu Candida a, což je důležité, jinými metodami [4].
Fungicidní aktivita flukonazolu v různých přípravcích tedy není stejná. Diflucan má nejvyšší statisticky významnou fungicidní aktivitu na všechny tři modelové kmeny kvasinek v maximálních (150 mg/ml) a minimálních (2 mg/ml) koncentracích.
Nejcitlivější druhy na drogu byly C. albicans и C. parapsilosis. Potlačuje růst C.glabrata statisticky významně výraznější než ostatní léky.
Reference
1. Ankirskaya A.S., Muravyova V.V., Mironova T.G. a další Genitální kandidóza ve struktuře oportunních infekcí pochvy. Principy laboratorní diagnostiky a význam sledování citlivosti hub na antimykotika // Akush. a gin. – 2009. – č. 5. – S. 31-37.
2. Ankirskaya A.S., Muravyova V.V., Fursova S.A.. Sledování druhové skladby a citlivosti na antimykotika kvasinkovitých hub izolovaných z pochvy žen v reprodukčním věku. //Klín. microbiol. antimikrobiální chemoterapie – 2006. – T. 8, č. 1. – S. 87-95.
3. Burova S.A. Vlastnosti výskytu a komplexní léčba vulvovaginální kandidózy. // Ošetřující lékař. – 2003. – č. 4. – S. 53-56.
4. Vasilyeva N.V., Vybornova I.V., Elinov N.P. Citlivost druhů Candida na flukonazol a některá jeho generika v testech in vitro // Prob. Miláček. mikol. – 2002. – T.4, č. 2. – S. 43-44.
5. Kungurov N.V., Gerasimova N.M., Višněvskaja I.F. Moderní představy o léčbě urogenitální kandidózy // Ošetřující lékař. – 2004. – č. 6. – str. 46-48.
6. Kunelskaya V.Ya. Zkušenosti s použitím mykoflukanu (flukonazolu) v léčbě faryngomykózy. // Ošetřující lékař. – 2005. – č. 1. – S. 67-69.
7. Sidorenko S.V., Kolupaev V.E. Antibiogram: metoda diskové difúze. interpretace výsledků // http://www.rusmedserv.com/microbiology/standard/article_5html.
8. Smetnik V.P., Marčenko L.A., Chernukha G.E. Zkušenosti s použitím mykoflukanu (flukonazolu) k léčbě vulvovaginální kandidózy // Ošetřující lékař. – 2004. – č. 2. – S. 73-76.
9. Talibov O.B. Generika a léková ekvivalence. http://www.rusmg.ru.
10. Pfaller MA, Diekema DJ, Rinaldi M. a kol. Gibbs and the Global Antifungal Surveillance Group. Výsledky globální antifungální dozorové studie ARTEMIS DISK: 6.5letá analýza citlivosti Candida a dalších druhů kvasinek na flukonazol a vorikonazol pomocí standardizovaného diskového difúzního testování. //J. Clin. Microbiol. —2005. – Sv. 43, č. 12. – S. 5848–5859.
O autorech / Pro korespondenci
Zheltikova Tatyana Mikhailovna, doktorka biologie. vědy, hlav laboratoř. Instituce Ruské akademie lékařských věd Výzkumný ústav vakcín a sér pojmenované po. I.I. Mechnikov RAMS
Adresa: 105064, Moskva, Maly Kazenny lane, 5a
Телефон: 8(495)917-42-55
E-mail: t-zhelticova@yandex.ru
