K dnešnímu dni bylo dosaženo významného pokroku v molekulární biologii, genetickém inženýrství a biotechnologii. Metoda umělé inseminace a kultivace embryí in vitro se stává rutinou. Byly zvládnuty způsoby získávání embryonálních kmenových buněk a transgenních zvířat. Tkáňové inženýrství se aktivně rozvíjí.
Všechny tyto oblasti moderní biologické vědy úzce souvisejí s procesem embryogeneze savců, jejichž druhová charakteristika významně ovlivňuje metodiku biotechnologického výzkumu.
Druhově specifickým rysem fyziologie březosti u koní je, že embryo je po opuštění dělohy na dlouhou dobu slabě spojeno s endometriem a lze jej odstranit nechirurgickou metodou (od 6. do 7. 36 dnů těhotenství). Díky této biologické vlastnosti embryonálního období mají koně možnost podrobně studovat ranou embryogenezi, což je u jiných druhů nemožné bez poškození zdraví jedince.
Cílem našeho výzkumu bylo provést morfohistologické studie koňských embryí od 8. do 36. dne prenatálního vývoje a charakterizovat hlavní fáze morfogeneze,
Metodologie výzkumu. Embrya byla získána nechirurgickou metodou od mladých těžkých tažných klisen na farmě VNIIK koumiss, přičemž se stáří embrya počítalo od data ovulace. Výsledný materiál byl fixován ve 4% vodném roztoku formaldehydu a poté vyfotografován v Centru počítačové videoskopie Moskevské státní univerzity pomocí digitálního fotoaparátu Olimpus. Výsledné fotografie byly zaznamenány na laserový disk. Histologické preparáty byly připraveny v Centrální vědecké výzkumné laboratoři Rjazaňské lékařské univerzity za použití standardních metod. Skleněné diapozitivy s histologickými řezy pak byly fotografovány také na Moskevské státní univerzitě. Pomoc při přípravě a dekódování neporušeného a zpracovaného embryonálního fotografického materiálu poskytla M.L. Semenova, docentka katedry embryologie Moskevské státní univerzity
Výsledky výzkumu. Pro morfohistologické studie rané embryogeneze koní bylo získáno 33 embryí ve věku 8 až 36 dnů. Ze všech získaných embryí včetně jejich extraembryonálních částí (membrán) byly připraveny histologické preparáty.
Po analýze vlastního výzkumu jsme došli k závěru, že embryonální období vývoje koňského embrya lze rozdělit do tří podobdob: preneurulace (od okamžiku oplození do 15-16 dnů vývoje), neurulace (od 15-16 dnů až 20-21 dnů) a počáteční fáze organogeneze nebo pozdní embryonální období (21-22 dnů před implantací).
V předneurulačním podobdobí předchází morfologické diferenciaci fáze oplození, štěpení a tvorby blastocyst.
Embrya koní, která jsme získali ve věku 8-11 dnů, byla ve stádiu expandované blastocysty a měla různé průměry. V oblasti embryoblastu dochází k aktivnímu pohybu buněk: zárodečný uzlík se mění na dvouvrstvý zárodečný disk (rozlišuje se epiblast a hypoblast). Stěna blastocysty má také dvouvrstvou strukturu: trofoblast a vrstvu buněk primárního extraembryonálního endodermu. Trofoblast je vrstva hustě zabalených epitelizovaných buněk, to znamená, že jsou určitým způsobem orientovány. Jádra v nich jsou velká. Vnitřní povrch buněk trofoblastu je hladký, vnější povrch je nerovný (pravděpodobně kvůli přítomnosti velkých vakuol pod ním). Primární endoderm představují buňky s vysoce zploštělými okraji, které jsou ve vzájemném kontaktu.
Do 12. dne vývoje jsou buňky trofoblastu obklopující blastocoel zevnitř porostlé endodermem, čímž se dokončí přeměna blastocysty na dvouvrstvý žloutkový váček. Primární endoderm se obecně řídí stejným vzorem jako předchozí embrya. Silně zploštělé okraje buněk jsou v užším kontaktu s trofoblastem.
Od 13. dne vývoje se v důsledku migrace a proliferace buněk objevuje v zárodečném disku primární pruh: objevují se mezodermální buňky a dvouvrstvý zárodečný disk se stává třívrstvým. Stěna žloutkového váčku zůstává stále dvouvrstvá. Buňky podílející se na tvorbě primární zárodečné oblasti migrují primitivním pruhem a tvoří třívrstvý žloutkový váček, objevují se první izolované ostrůvky krvinek.
Do 16. dne pokrývá rychle se vyvíjející mezodermální vrstva více než polovinu žloutkového váčku a dělí se na somatické a splanchnické vrstvy, oddělené coelomickou dutinou. Ve splanchnopleuře jsou viditelné malé krevní cévy.
Od 16. dne vývoje začíná neurulační podobdobí. Vyznačuje se tím, že před primárním pruhem je vytvořena analáž nervového systému ve formě široké desky. Brzy se okraje nervové desky zvednou a vytvoří nervové záhyby. Mezi hřebeny je neurální rýha. Téměř současně se z mezodermu tvoří somiti. Embryo, které jsme získali v tomto věku, má dobře vytvořenou nervovou rýhu s nervovými hřebeny. V blízkosti žlábku se na pravé a levé straně nachází 9 párů somitů. Nervové záhyby cefalické nervové ploténky jsou zesílené. Důležitým rysem této fáze vývoje je přítomnost tří kosočtverců. Objevují se jako malé vychýlení nervových záhybů. Nervová rýha končí anláží primitivního střeva.
18-19 den vývoje se okraje primárních hřebenů uzavřou podél střední čáry a vytvoří se uzavřená neurální trubice. Kraniální a kaudální úseky nervové trubice zůstávají otevřené po dlouhou dobu. Říká se jim přední a zadní neuropóry. Přední neuropór se uzavře 20.–21. den a zadní 21.–22. den. V období neurulace dochází u koňského embrya k tvorbě srdce. V 18. dni vývoje vypadá srdeční analage jako srdeční vak uzavřený v myoepikardiálním jádru. Uvnitř dutiny srdečního vaku jsou krvinky.
21. – 22. den vývoje je neurulace dokončena a začíná aktivní tvorba orgánů – organogeneze. V této fázi se objevují základy končetin a formují se hlavní orgánové systémy. 21denní embryo, které jsme získali, vypadá jako otazník. Neurulace není úplná. Přední neuropór je uzavřen, zadní část páteřního kanálu je otevřená a končí širokým kuželovitým ocasním pupenem. V hlavové části začíná tvorba očních váčků (na ventrální straně váčku), dochází ke vzniku sluchových jamek a dvou žaberních oblouků. Náplasti srdce a jater jsou jasně viditelné.
22denní embryo má tělo ve tvaru C. Hřebeny neurální trubice jsou uzavřeny. Přední a zadní neuropóry jsou uzavřeny. Ledviny předních končetin jsou dobře viditelné. Srdce se skládá ze dvou komor a obsahuje krev. Začne se vyvíjet samotný cévní systém embrya.
Tělo 23 dnů starého embrya je prohnuté do tvaru beraního rohu. V hlavové části jsou patrné 2 páry žaberních oblouků a začátek tvorby třetího. Tvoří se oční váčky. Somitogeneze je pravděpodobně dokončena, protože somity jsou rozšířeny až ke špičce ocasu. Existují ledviny předních a zadních končetin. Srdeční dutina je naplněna krví, velké tělesné cévy a cévní síť mesonefros jsou dobře vyvinuté.
26. den vývoje je tělo zárodku stále prohnuté do tvaru beraního rohu. Přední a střední mozkové vezikuly jsou odděleny centrální rýhou. Optické pohárky s čočkami a třemi páry žaberních oblouků jsou dobře vyvinuté. Ve viscerální části se vytvoří fossa stomodeum (budoucí ústní otvor). Mesonefros je dobře formován a skládá se z řady renálních glomerulů a tubulů. Na ventrální straně těla, mezi ledvinami zadních končetin a ocasem, je patrné analáž močového měchýře.
Tělo 30-36denních embryí má tvar C (mění se pouze úhel okcipitální křivky). Je jasně patrná diferenciace mozkových váčků. Ve viscerální části začíná redukce žaberního aparátu. Vytváří se dutina ústní a nosní otvory. Optické pohárky jsou pigmentované. Ledviny předních a zadních končetin jsou výrazně prodloužené.
Během embryonálního období u koně, na rozdíl od jiných zemědělských druhů. zvířat, placenta funguje hlavně v chorioyologis. Mezi embryonálním vakem a děložní sliznicí není těsné spojení. Specifickým rysem u koní je, že embryonální váček zůstává kulatý během prvních 6-8 týdnů březosti.
Embryo ve věku 22 dnů je zcela uzavřeno v amnionu a nachází se ve středu embryonálního močového měchýře. Reliéfně vystupují vitelinové cévy a sinusová zakončení obklopující amniový vak, tvořící okraj vyvíjejícího se mezodermu. V avaskulární oblasti močového měchýře plodu jsou choriové výrůstky, které jsme poprvé objevili 20. den embryonálního vývoje.
Do 23. dne mezoderm s dobře vyvinutými cévami obklopuje přibližně 2/3 stěny plodového vaku. V avaskulární oblasti neembryonálního pólu, pod sinusovými zakončeními, je dobře patrný choriový pás. Embryo je zcela obklopeno amnionem. V této době se vyvíjející se alantois stává jasně viditelným jako váčkovitá vnější kapsa zadního střeva embrya. Ve stěně allantois jsou vidět krvavé ostrovy.
26. den zabírá nyní dobře vaskularizovaný alantois asi ? objem amniotického vaku; rozbíhá se kolem zadního střeva embrya, rozšiřuje se přes amnion a do extraembryonální dutiny. Stěna alantois a chorionu na embryonálním pólu tvoří allantochorion (fúze těchto membrán není v tomto věku pozorována). Mezoderm nyní pokrývá více než ? stěny membrán, přičemž na neembryonálním pólu zůstává pouze malá nevaskularizovaná oblast.
33denní embryo je uzavřeno v elipsoidní amnii. Allantois zaujímá téměř polovinu celkového povrchu embryonálního vezikula. Embryo se přesune k neembryonálnímu pólu a je připojeno žloutkovým stonkem (budoucí pupeční šňůrou) k regresujícímu žloutkovému váčku. Choriový pás se nachází na přechodu dolní a střední třetiny embryonálního váčku.
Předpokládá se, že do 40. dne je choriový pás zcela oddělen od membrán; na jeho místě zůstává malá vrstva trofoblastu a žloutkového váčku, který tvoří neembryonální pól.
Výkon
Získaná data umožňují významně doplnit a konkretizovat dosavadní informace o procesech morfohistogeneze probíhajících v embryonálním období u koňských embryí. Výzkumné materiály mohou sloužit jako základ pro vytvoření embryologického atlasu koně.
Mezi domácími zvířaty je rychlost obnovy populace u koní nejnižší a lidé vždy snili o zrychlení intenzity selekce v chovu koní. To je možné pouze zvýšením počtu narozených hříbat z jedné klisny včetně dvojčat. Příroda však rozhodla, že to je normálně nemožné.
Všichni vědci se shodují na jednom – koně jsou přísně monoparní zvířata. Jakákoli vícečetná březost je u klisen patologickým typem březosti a je třeba se jí všemi možnými způsoby vyhnout.
Dvojčata nebo trojčata u klisen vznikají hlavně oplodněním dvou nebo více vajíček v jednom sexuálním cyklu. Jednovaječná dvojčata, která se vyvinou z jednoho oplodněného vajíčka, jsou u koní extrémně vzácná.
Mezi faktory ovlivňující vícečetnou březost patří genetická predispozice, reprodukční stav a věk klisny, denní světlo (v přechodném období, tedy na podzim, v zimě a brzy na jaře je procento dvojčat vyšší).
Vícečetná březost u klisen ve většině případů končí potratem, pouze v 1 případě z 5000 se obě hříbata narodí živá.
Nejčastěji porod s dvojčaty vyžaduje porodnickou péči. Klisny po dvojčatech přitom zůstávají 1-2 sezóny svobodné. Hříbata dvojčata jsou obvykle menší než jejich vrstevníci a vyžadují zvláštní pozornost v prvních měsících života.
Příroda stanovila přirozené mechanismy, jak zabránit dvojčatům u klisen. Jedná se o soutěž mezi folikuly během zrání, kdy vyčnívá ten vedoucí a potlačuje vývoj ostatních. Pokud je tato bariéra překonána, pak se tělo pokusí zbavit takového těhotenství v časném stadiu a často končí těhotenství embryonální smrtí v důsledku placentární insuficience.
Synchronní dvojčata umístěná vedle sebe.
Spolu s tím existují i mechanismy, které jsou řízeny chovatelem. Za prvé, nejjednodušší je přeskakování říje, když dozraje několik folikulů, druhým způsobem je vyřazení klisen náchylných k dvojčatům. Jedná se o tzv. pasivní metody. Existují také aktivní metody řešení tohoto problému při otěhotnění: ukončení těhotenství hormonálními léky před 35. dnem, stejně jako ruční vymáčknutí jednoho z embryí pod ultrazvukovou kontrolou (během mobilní fáze ve dnech 13-16, popř. fixace do 30 dnů).
Odhalit současný vývoj dvou nebo více folikulů, stejně jako rozpoznat vícečetné těhotenství, je pouze provedením ultrazvuku, protože ani zkušený odborník, který zná metodu rektální palpace vaječníků, to nemůže vždy zjistit. Proto je důležité provést ultrazvuk 14. den po poslední inseminaci.
I zde však občas dojde k překvapení.
Prvním překvapením je asynchronní ovulace dvou a více folikulů. Pokud tento okamžik promeškáme, pak při sledování 14 dní nebo dříve uvidíme jedno standardní embryo a druhé může být tak malé, že se na ultrazvuku nezobrazuje. Pokud poté neproběhnou žádná další vyšetření, pak druhé miminko, které se objeví o den nebo dva později, bude pokračovat ve svém vývoji a majitel se o jeho existenci dozví během potratu nebo porodu.
Toto překvapení lze předvídat a včas rozpoznat, pokud je klisna při připouštění nebo inseminaci neustále pod kontrolou a pouze pokud vidíme, že došlo k několika ovulacím (vždy je vhodné druhý den po ovulaci provést kontrolní ultrazvuk pro kontrolu kvality žlutého tělíska a stavu dělohy), pak ve 14. a 16. dni provádíme kontrolu těhotenství, abychom taková asynchronní dvojčata nepromeškali.
Starší plod z asynchronních dvojčat
Mladší plod z asynchronních dvojčat
Dalším překvapením, které je naštěstí extrémně vzácné, jsou jednovaječná dvojčata. Ve vědecké literatuře je popsáno pouze několik spolehlivých případů dvojčat, která se vyvinula z jednoho vajíčka bez použití biotechnologie.
Mechanismus vzhledu je následující. Po oplodnění je zygota v určitém okamžiku (před tím, než se stane patrnou na ultrazvuku) rozdělena na dvě embrya. Vývoj takových dvojčat závisí na tom, v jaké fázi vývoje k tomu dojde. Existují monoamniální dvojčata s jedním amniem (bílý váček) a společným chorionem (šedý váček), ale nejčastěji jsou výsledkem dva plody se dvěma amniony a jedním chorionem, méně často zcela oddělené. V prvním případě bude během standardního kontrolního období 13-15 dní pouze jedna bublina, nebudou v ní žádné znatelné přepážky, ty se objeví později.
Nedávné studie popsaly pozorování podobných případů vyplývajících z přenosu jednotlivých embryí získaných in vitro. Incidence byla 1,6 %, zatímco u in vivo embryotransferu se žádné podobné případy nevyskytly. Přítomnost druhého plodu navíc nebyla detekována ve standardním kontrolním období 14-15 dnů a vícečetná gravidita byla známa na ultrazvuku po 25. dnu, kdy byl jasně viditelný tep obou plodů.
Ale i zde je prostor pro diagnostickou chybu. Pokud si odborník, který prováděl inseminaci a management klisny v průběhu celého cyklu předtím, je jistý jedinou ovulací a ve standardní době byl detekován pouze jeden plodový vak, pak rychlým ultrazvukovým vyšetřením za 20-23 dní bez nastavení úkol detekovat vývoj dvou hříbat, Je docela možné nevidět dvě blízko umístěná embrya. Taková pozornost přichází se zkušenostmi. Navíc ne všichni specialisté, kteří se věnují výhradně umělému oplodnění, mají ultrazvukové přístroje s dobrým rozlišením, pak může být druhý neočekávaný plod zaměněn za artefakt. V obdobích delších než 40 dní plod klesá na dno dělohy a ne všechna zařízení mohou dosáhnout takové hloubky (více než 10 cm)
Bohužel od takového těhotenství nelze očekávat příznivý výsledek a vzhledem k těsné blízkosti plodů je obtížné snížit těhotenství na jednočetné. Za nejsprávnější řešení problému v případě jednovaječných dvojčat by mělo být považováno úplné přerušení březosti injekcí prostaglandinu, čím dříve se tak stane, tím rychleji může být klisna znovu inseminována.
Ultrazvukové monitorování procesu a výsledku nadměrné redukce embryí
Během naší praxe jsme se s vícečetnými porody setkali minimálně 21krát. Z toho bylo 19 dvojčat a dvě trojčata. Z toho bylo 17 vícečetných těhotenství diagnostikováno v časném stadiu a jedno v období 26 dnů, což umožnilo v 15 případech provést manuální redukci a snížit těhotenství na jediné těhotenství, včetně období 26 dnů ( plody se vyvíjely v různých rozích). Ve dvou případech došlo k odumírání přebytečného plodu samovolně a těhotenství zůstalo jako jednočetné, v jednom případě obě embrya zemřela při redukci, v dalším případě obě embrya utrpěla předčasnou embryonální smrt bez zásahu člověka a ve dvou dalších případech druhé embryo zemřel po redukci v období do 20 až 40 dnů. Ve dvou ze všech případů nebyla ultrazvuková kontrola provedena, v důsledku toho se narodila dvě živá dvojčata, ale hříbata vyžadovala další pozornost a nedorostla.
A další dvojče nebylo při ultrazvukové kontrole včas rozpoznáno, v důsledku toho klisna ve druhém trimestru potratila, ale vyšetřením se zjistilo, že dvojčata jsou identická, což byl důvod, proč nebyla na klisně rozpoznána. standardní lhůta 14 dnů.
Výsledkem bylo, že po manuální repozici zůstalo těhotenství ve 12 z 15 případů (80 %).
Takže shrnuto, jak se vyhnout problémům vícečetných porodů při chovu koní.
První, a hlavně je pravidlem jasná ultrazvuková kontrola vývoje folikulů a ovulace během inseminačního cyklu. Pokud existuje riziko mnohočetné ovulace, neprovádějte umělé oplodnění nebo přerušte páření/inseminaci čerstvým spermatem.
Druhý. Pokud došlo k inseminaci/páření a byla zjištěna mnohočetná ovulace. První kontrola ultrazvukem pro těhotenství by měla být provedena od 12-13 dnů každý den až do 16. dne, kdy již mohou být jasně viditelné všechny plodové obaly.
Třetí. Pokud je zjištěno vícečetné těhotenství. Posuďte šance na redukci těhotenství na normální jednočetné těhotenství ručním rozdrcením přebytečných plodů. Pokud jsou plodové obaly velmi blízko, přejděte ke čtvrtému pravidlu.
Čtvrtý. Není-li možné zredukovat jeden plod bez rizika pro druhý, buďte se rozhodnout odstranit oba (abyste neztráceli čas čekáním), nebo ponechat oba plody do 20-40 dnů, kdy může jeden z nich spontánně zemřít (toto se stává poměrně často) a pokud jsou oba plody zachovány, použijte k ukončení těhotenství prostaglandin.
A konečně, páté pravidlo o jakémkoli hříběti. Striktně dodržujte kontrolní období ultrazvuku po inseminaci: 13-14 dní, 20-23 dní, 30 dní, 40-45 dní, 65-70 dní a ultrazvukoví specialisté musí být vždy kritičtí k vyšetřením ve všech fázích, pečlivě si prostudujte, co vidí, hledat přítomnost odchylek od normy.
