Testování nových zubních implantátů, jejich porovnávání s již používanými a testování nových implantačních metod se provádí na pokusných zvířatech. K tomuto účelu se nejlépe hodí králíci, zejména proximální kondyl jejich tibie je strukturou podobný čelistním kostem. Navíc je tato část končetiny u těchto zvířat snadno dostupná. V souvislosti s výše uvedeným je uvedena podrobná metodika experimentálního zavádění zubních implantátů do tibie králíků. Podrobně a krok za krokem je popsán průběh anestezie, chirurgický zákrok k implantaci, vyřazení zvířat z experimentu, odběr materiálu pro následné morfologické vyšetření, ale i fáze přípravy bioptovaných objektů ke studiu pomocí světelné mikroskopie. Předkládaná metodika usnadní práci s pokusnými zvířaty, do určité míry standardizuje postup a umožní získat randomizovaná data vhodná pro statistické zpracování.
experimentální model dentální implantace
techniky práce s králíky
příprava tkání pro morfologické studie
1. Mayborodin I.V., Toder M.S., Shevela A.I., Razumakhina M.S., Shevela A.A., Patrushev A.Yu., Ragimova T.M., Kuznetsova I.V. Histologické výsledky implantace kovových výrobků s drsným a hladkým povrchem do kostní tkáně v experimentu // Fundamental Research. – 2014. – č. 7-1. – s. 114-118.
2. Carroll G.L. Anesteziologie a analgezie malých domácích zvířat [překlad z angličtiny] / G.L. Carroll. – M.: Aquarium-Print, 2009. – 294 s.
3. Polatayko O.R. Veterinární anestezie / O.R. Polatayko. – Kyjev: VD „Periskop“, 2009. – 408 s.
4. Imunocytochemické metody a protokoly: 2. vyd. /Ed. by Javois LC // Metody v molekulární biologii. – sv. 115. – Humana Press: Totowa NJ. – 2003. – 457 s.
5. Histologické protokoly [Text] / Ed. od TD Hewitson, IA Darby // Metody v molekulární biologii. – sv. 611. – Humana Press, 2010. – 229 s.
6. Voino-Yasenetsky M.V. Zdroje chyb v morfologickém výzkumu [Text] / M.V. Voino-Yasenetsky, Yu.M. Jabotinský. – L.: Medicína, 1970. – 320 s.
Při neustálé práci s laboratorními zvířaty a provádění experimentálních výzkumů se potýkáme s nemožností opakovat ten či onen experiment kvůli nedostatku malých detailů v původních článcích autorů. Drobné a zdánlivě nepodstatné detaily přitom mohou hrát důležitou roli při interpretaci výsledků. Například mnoho článků jednoduše uvádí implantaci různých materiálů do tibiálního kondylu králíků. Při pokusu o studium dalších implantátů je nutné přepracovat všechny detaily: od anestezie, na kterou jsou tato zvířata velmi citlivá, až po specifika přípravy bioptických vzorků pro morfologické výzkumné metody [1]. To vše posloužilo jako základ pro vznik tohoto rukopisu, který může, jak doufáme, usnadnit práci dalším autorským týmům právě začínajícím experimentálním výzkumem.
Zubní implantace je způsob implantace umělého zubního kořene (implantátu) do horní nebo dolní čelisti. Jako podpěry se používají implantáty, na které se fixují buď korunky (plně nahrazující ztracené zuby) nebo snímatelné protézy (v tomto případě implantáty přispívají k adekvátní fixaci protézy v dutině ústní). Konstrukce implantátu se skládá ze dvou hlavních částí – samotného implantátu, což je titanový šroub chirurgicky implantovaný do čelisti, a abutmentu (vnější část implantátu – ve tvaru broušeného zubu), který je připevněn k implantátu po období hojení.
Testování nových produktů, jejich porovnávání s již používanými a testování nových implantačních metod se provádí na pokusných zvířatech. K tomuto účelu se nejlépe hodí králíci, zejména proximální kondyl holenní kosti, který svou strukturou těsně odpovídá čelistním kostem. Navíc je tato část končetiny u těchto zvířat snadno dostupná. V tomto ohledu mnoho výzkumníků používá takový model pro experimentální implantaci [1]. Takové práce však pouze konstatují fakt použití tohoto modelu a obsahují výsledky experimentů. Přesné a malé detaily práce s králíky při zavádění různých implantátů do jejich kostních tkání jsou v moderní literatuře zjevně nedostatečné, ačkoli tyto detaily mohou značně usnadnit práci výzkumníků, kteří právě začínají experimentální studium interakce cizích těles s tkáněmi živého. organismus.
Je třeba hned říci, že kostní struktury podobné stavbě jako kosti čelistní jsou také přítomny v lopatkách a pánevních kostech. Přístup k nim však obnáší rozsáhlou operaci a značná přidružená traumata, která mohou významně ovlivnit získané výsledky. Navíc na základě vlastní zkušenosti je třeba poznamenat, že pokusy o vytvoření otvoru pro implantaci na lopatku často končí její destrukcí, roztříštěním na více částí.
Tibiální kondyly z laboratorních miniprasátek jsou vhodné i pro modelaci dentální implantace. Ale chirurgický přístup ke kondylům u těchto zvířat je obtížnější než u králíků, je to způsobeno silnější a hustší kůží, výrazným podkožím a zvláštnostmi průchodu krevních cév tam.
V souvislosti s výše uvedeným uvádíme podrobnou metodiku experimentálního zavádění zubních implantátů do tibie králíků.
Výzkumný materiál. Hrubý implantát s pískovaným a kyselinou leptaným povrchem (10S, Izrael) a hladkým leštěným povrchem pro bikortikální implantaci (3S, Izrael) byl implantován do proximálního tibiálního kondylu 3 králíků [1].
Zvířecí anestezie. Veškeré manipulace se zvířaty nebyly spojeny s vyvoláváním bolesti a byly prováděny v souladu s „Pravidly pro provádění prací na pokusných zvířatech“ (Nařízení MZ SSSR č. 755 ze dne 12. srpna 1977; Nařízení SSSR Ministerstvo vyššího a středního speciálního školství č. 742 ze dne 13. listopadu 1984).
Mnoho příruček pro práci s laboratorními a experimentálními zvířaty obsahuje metody anestezie a analgezie [2, 3]. Často však neexistují přesné dávkování používaných léků. Implantace byla provedena za dodržení všech pravidel asepse a antisepse na čistém operačním sále v celkové anestezii na základě celkové intravenózní anestezie propofolem. V počátečním stádiu byla napíchnuta marginální žíla ušního boltce a katetrizována katetrem 24 G, který byl fixován lepicí páskou. Byla provedena intravenózní premedikace: atropin sulfát 0,1% – 0,22-0,27 mgkg; difenhydramin 1 % – 4,6-5,2 mg/kg; droperidol 0,25 % – 1,25 mg; ketorolac trimethamin 1% – 10 mg. K navození anestezie byl použit propofol 1% – 15 mg/kg intravenózně, k udržení anestezie byl také použit propofol 1% – 25-30 mg/kg/hod intravenózně. Infuzní terapie byla prováděna s 0,9% roztokem chloridu sodného 15-25 mlkg, v závislosti na závažnosti krevní ztráty. Respirační podpora byla v případě potřeby provedena maskovou metodou s insuflací 100% kyslíku.
Průběh implantace v experimentu. V celkové anestezii byly nůžkami odstraněny chloupky v místě zamýšleného chirurgického zákroku na obou končetinách v oblasti kolenních kloubů (obr. 1a). Po manipulaci byla kůže ošetřena alkoholem a operační pole bylo překryto sterilním ubrouskem s otvorem.
Levá končetina byla zvolena pro implantaci produktů s drsným povrchem a pro zavedení leštěných implantátů. Je třeba poznamenat, že zavedení každého typu implantátu do stejné končetiny za prvé umožňuje urychlit samotný postup implantace, protože není nutné registrovat, kterému zvířeti byl do které končetiny implantován konkrétní produkt; za druhé usnadňuje následné pozorování a zkoumání zvířat.
Rýže. 1. Přístup k proximálnímu kondylu holenní kosti králíka (místo experimentální implantace): a – zastřižení srsti, b – incize kůže jednorázovým skalpelem podél přední linie pod kolenním kloubem, c – měkké tkáně jsou od sebe odtlačeny čelistmi svorky, d – obnažení povrchu proximálního tibiálního kondylu s rašplými kůstky na anteromediální straně
Rýže. 2. Zavedení implantátu s drsným povrchem do proximálního kondylu tibie králíka: a – začátek vrtání otvoru pro implantaci zubní frézou, b – začátek zašroubování implantátu, c – pomocí klíče s stupnice točivého momentu, d – V důsledku manipulace je implantát téměř zcela zapuštěn do kostní tkáně
Sled manipulací pro zavádění implantátů s drsným povrchem (obr. 1, 2):
1. Vlevo podél přední linie, mírně pod kolenním kloubem, byl jednorázovým skalpelem proveden kožní řez (obr. 1b).
2. Pomocí tupé metody (uzavřené čelisti svorky) byly tkáně odtaženy k periostu (obr. 1c).
3. Povrch proximálního kondylu tibie na anteromediální straně byl exponován pomocí rašple (obr. 1d).
4. Pomocí zubní frézy, dokud nebyl pociťován pocit „selhání“, byl ve vybrané oblasti vytvořen otvor. Byly použity dva frézy se zvětšujícím se průměrem (obr. 2a).
5. Do vytvořeného otvoru byl zašroubován implantát s drsným povrchem, nejprve ručně, poté pomocí klíče se stupnicí momentu, což umožňuje ovládat vytvořenou sílu. Hlavička implantátu vyčnívala nad povrch kosti maximálně o 1 mm (obr. 2b-d).
6. Operační rána byla sešita po vrstvách 5–0 vikrylem.
7. Kožní stehy byly ošetřeny 5% alkoholovým roztokem jódu.
Pro instalaci leštěných implantátů byly přesně stejné manipulace provedeny na pravé končetině.
Během 1–2 týdnů po operaci se zvířata zbaví stehů sama, na kůži v místě operace nejsou žádné vizuální známky akutního zánětlivého procesu (obr. 3a). Ve většině případů pro všechna období byly implantáty umístěny v místě vpichu: v proximálním kondylu tibie (obr. 3b, c). Je třeba poznamenat, že 4 týdny po implantaci se v místě hlav implantátů (kontakt s periostem) objevují příznaky podráždění (ztluštění), po 2 měsících se tyto příznaky zvýraznily.
Komplikace experimentální implantace. V souboru jako celku byl zaznamenán jeden případ osteomyelitidy po implantaci hrubých a leštěných implantátů (různá zvířata). Při posledním pozorování byla nalezena zlomenina končetiny v místě implantace, komplikace byla nalezena 1 týden po operaci a s největší pravděpodobností nastala přímo při nebo bezprostředně po zavedení cizího tělesa. Tato zvířata byla vyřazena a neúčastnila se dalších studií.
Vyjmutí zvířat z experimentu, odstranění implantátů, příprava materiálu ke studiu pomocí morfologických metod. Zvířata byla vyjmuta z experimentu 2 a 6 měsíců po implantaci předávkováním inhalační etherovou anestezií.
Vzhledem k tomu, že před odstraněním cizích těles je nutné zhodnotit stav okolních tkání a určit přítomnost hnisavých komplikací v jejich okolí, je vhodné nejprve kompletně odstranit kůži z končetiny od tříselného záhybu až po kotník. V případech, kdy byla hlavice implantátu pokryta tkání, byla uvolněna skalpelem (obr. 4a, b). Poté byl aplikován klíč s momentovou stupnicí a implantát byl postupně vyšroubován, přičemž byla zaznamenána síla na začátku jeho rotace (obr. 4c, d). Po odstranění cizího tělesa zůstal v tkáni otvor s hladkými okraji a stopy po okrajích závitu (obr. 4d).
Po vyšroubování implantátů je nutné makro- a mikroskopickými metodami zjistit přítomnost a objem tkáňových fragmentů na jejich povrchu (obr. 5a-d).
Pro následné morfologické vyšetření byla celá tibie po maximálním odstranění měkké tkáně fixována ve 4% roztoku paraformaldehydu ve fosfátovém pufru alespoň na 1 den [4, 5]. Kost byla poté odvápněna roztokem na bázi EDTA, který méně poškozuje tkáň než kyselé odvápnění. Délka léčby byla stanovena pokusem proniknout do kosti pitevní jehlou z otvoru po odstranění implantátu. Odvápnění bylo zastaveno, když kost změkla a pružila a mohla být snadno řezána skalpelem [4, 5].
Veškeré manipulace s předmětem, které vedou k jeho poškození, je nejlepší provádět po fixaci, aby se vyloučily pochybnosti o intravitálních změnách [6] a následná dekalcifikace kost měkne a usnadňuje vyříznutí potřebného fragmentu pro následné zpracování; navíc dehydratovaná kost nepraská.
Dále byly kostní fragmenty s dírou dehydratovány za stálého míchání v ethanolu o zvyšující se koncentraci, vyčištěny v xylenu a zality do plastifikovaného parafínu podle následujícího schématu [4, 5]:
1. Ethanol 50 % – 2 hodiny;
2. Ethanol 70 % – 2 hodiny;
3. Ethanol 80 % – 2 hodiny;
4. Ethanol 90 % – 2 hodiny;
5. Ethanol 96% (v této fázi a dále je možné nahradit ethanol čistým butanolem, propanolem nebo ispropanolem) – 2 hodiny;
6. Ethanol 96% smíchaný s benzenem 1:1 (dále je možné benzen nahradit xylenem nebo toluenem, je třeba vzít v úvahu, že benzen dává lepší výsledek, ale zároveň je těkavější a jedovatější) – 2 hodiny;
7. Ethanol 96% smíchaný s benzenem 1:1 – 2 hodiny;
8. Benzen – 2 hodiny;
9. Benzen – 2 hodiny;
10. Benzen ve směsi s parafínem 1:1 – 2 hodiny (při zahřátí na bod tání směsi);
11. Benzen ve směsi s parafínem 1:1 – 2 hodiny (při zahřátí na bod tání směsi);
12. Parafín – 2 hodiny (při zahřátí na bod tání parafínu, ale ne více než 67 ºС).
V případě potřeby můžete proceduru přerušit na dobu nejvýše 1 dne ve fázi degradace v alkoholech, v jiných fázích je prodlužování doby zpracování nežádoucí.
Tento postup netrvá déle než jeden den, lze jej snadno automatizovat a umožňuje získat kvalitní histologické řezy o tloušťce nejvýše 5 mikronů, vhodné pro následné barvení a studium na světelně optické úrovni se zvětšením až až 1200 (obr. 5e, f).
Rýže. 3. Výsledky implantace po 2 týdnech: a – v místě operace nejsou viditelné známky zánětu, nejsou žádné stehy, b – je lokalizován implantát s drsným povrchem, dle výsledků RTG vyšetření v proximálním kondylu tibie bez příznaků osteomyelitidy a dráždění periostu, c – do pravého kondylu je vložen leštěný implantát, dle RTG dat nejsou žádné tkáňové reakce
Rýže. 4. Odstranění leštěného produktu z místa implantace, zvíře bylo vyjmuto z experimentu předávkováním éterovou anestezií, byla odstraněna kůže z končetinového segmentu. a – Tkáňový řez nad hlavicí implantátu. b – Hlavička implantátu je odkrytá, nejeví známky zánětu. c – Odšroubování implantátu klíčem se stupnicí momentu. d – Po odstranění implantátu zůstává v tkáních proximálního kondylu tibie otvor s hladkými okraji a stopami po závitu
Rýže. 5. Studium okolních tkání a povrchu implantátů 2 měsíce po jejich implantaci: a – Vyjmutý implantát s drsným povrchem 2 měsíce po implantaci. Fragmenty tkání jsou přítomny na různých strukturách výrobků, zejména na nitích implantátů, b – Vlákna výrobku s drsným povrchem obsahují velký objem živočišné tkáně. Mikrofotografie v odraženém světle bez zabarvení, c – Odstraněný leštěný implantát 2 měsíce po operaci. Povrch výrobku je lesklý, téměř čistý, d – Na strukturách leštěného implantátu je velmi málo fragmentů živočišné tkáně. Mikrofotografie v odraženém světle bez barvení,
e – 2 měsíce po implantaci leštěného produktu jsou v kostní tkáni proximálního kondylu tibie přítomny stopy od okrajů závitu šroubu. Dutiny vzniklé po odstranění cizího tělesa jsou vyplněny krví nebo fibrinem. Barvení hematoxylinem a eosinem, e – Stopy z okrajů závitu šroubu leštěného implantátu na protější stěně kondylu.
Barvení hematoxylinem a eosinem
Předkládaná metodika zavádění dentálních produktů králíkům za účelem testování nových implantátů, porovnávání nových s široce používanými, testování a výuka nových implantačních metod tak usnadní práci s pokusnými zvířaty, do určité míry standardizuje tento postup a poskytují možnost získat randomizovaná data, vhodná pro statistické zpracování.
SUKHUMI – V Abcházském institutu experimentální patologie a terapie probíhají jedinečné experimenty v boji proti rakovině. Na základě IEPiT vědci z Novosibirsku provedli řadu experimentů, aby studovali účinek hypertermie na králíky infikované lymfomem. Semjon Pegov zjistil, jaká jsou specifika této metody a zúčastnil se jednoho z unikátních experimentů.
Hypertermie je zvýšení přirozené tělesné teploty. Každý z nás to mohl sám pocítit, když onemocněl například chřipkou. Lékaři ze Sibiřského výzkumného ústavu v rámci svých experimentů uměle zvyšují tělesnou teplotu ponořením člověka – nebo v tomto případě králíka – do horké vody. Je to známá věc: při teplotách nad 42,5 stupně se bílkovina v krvi sráží a tělo umírá, ale novosibirským specialistům se podařilo tuto bariéru překonat.
„Díky našemu know-how se nám skutečně podařilo dosáhnout tohoto zlomového bodu, kdy při 42 stupních a výše tělo neumírá, ale přežívá, a to vše probíhá zcela bezbolestně a pro pacienta pohodlně, protože celá procedura je nesena ven v narkóze a pod pečlivým dohledem, s korekcí všech parametrů těla,“ říká Ilja Vasilevič, anesteziolog-reanimatolog ze Sibiřského výzkumného ústavu hypertermie.
Ve skutečnosti know-how sibiřských lékařů spočívá v použití speciálního léku během procedury – methenaminu. Podobné pokusy byly prováděny na lidech a ve více než třech tisících pokusů nedošlo podle odborníků k jedinému úmrtí. Jedním z úkolů studia vlivu hypertermie na živý organismus je najít způsob, jak bojovat s nemocemi, které jsou v moderní medicíně považovány za nevyléčitelné.
„Už jsem řekl, že pracujeme s lidmi, pracujeme s onkologií, s HIV infekcí a také s viry hepatitidy; alergická onemocnění velmi dobře reagují na léčbu metodou hypertermie, stejně jako pohlavně přenosné choroby,“ říká Ilja Vasilevič.
Abcházský experiment na králících
Vložit sdílení
Kód byl zkopírován do vaší schránky.
Adresa URL byla zkopírována do vaší schránky
- Sdílejte na Facebooku
- Sdílet na Twitteru
- Sdílejte na VKontakte
Momentálně není k dispozici žádný zdroj médií
0:00 0:05:00 0:00
V samostatném okně
Sibiřští lékaři zatím nemohou říci, že již našli všelék na rakovinu a AIDS, pozitivní změny v tomto směru však podle nich lze pozorovat již dnes. Právě za účelem studia vlivu hypertermie na různé rakovinné buňky přišli vědci do Abcházie. Zde na základě IEPiT provádějí pokusy na králících infikovaných lymfomem.
„Protože náš ústav IEPiT má tento model (ne každý ústav na světě se tím může pochlubit) – model lymfomu, který se naočkuje králíkům, projevili o něj zájem naši kolegové z Novosibirsku,“ říká Beslan Kobakhia, zástupce ředitele Výzkumného ústavu inovativních technologií Ruské federace.
Mohli jsme být svědky jednoho z unikátních experimentů. Psychologicky bylo těžké uvěřit, že králík zůstane naživu poté, co se jeho tělo zahřeje na teplotu přes 43 stupňů. Axiom, že se protein při této teplotě skládá, byl však před našima očima vyvrácen. Celá procedura trvala asi patnáct minut, indikátory jsme spolu s lékaři zaznamenávali na speciální teploměr, králík s tělesnou teplotou nad 43 stupňů byl během pár minut. Mohli jsme se přesvědčit, že nezemřel ani čtvrt hodiny po experimentu. Zda spolupráce mezi abcházskými IEPiT a novosibirskými lékaři přinese ovoce, se dozvíme nejdříve v lednu. V každém případě se však Abcházie hodlá i nadále zapojit do inovací v medicíně. Pro tyto účely se republika dokonce rozhodla vytvořit institut inovativních technologií, v jehož čele byl nabídnut Beslan Kobakhia, který se této oblasti v Rusku dlouhodobě věnuje.
„Naše rekreační domy, hotely, sanatoria jsou využívány, no, tři měsíce v roce, možná trochu víc, po zbytek času jsou prázdné. Pokud dokážeme prosazovat nové inovativní technologie v léčbě a stát v čele tohoto procesu, pak si myslím, že obsazenost všech zařízení resortu bude po celý rok stoprocentní,“ řekl Beslan Kobakhia.
V experimentech prováděných v Abcházii se využívá vývoj tří ústavů: našeho IEPiT, novosibirských lékařů a Výzkumného ústavu inovativních technologií Ruska. Při rehabilitaci králíků se bude používat tzv. aktivní voda. Pokud jde o hypertermii, v Rusku ji zatím nelze využít jako lékařskou službu, pacienti se mohou zúčastnit pouze výzkumu. Pokud se osvědčí, Abcházie může dobře využít inovace v medicíně k přilákání ještě více turistů do republiky.
Text obsahuje toponyma a terminologii používanou v samozvaných republikách Abcházie a Jižní Osetie
